You are here

Как отредактировать ДНК

Sunday, 5. April 2015 - 14:37

В последние годы возникли и получили широкое развитие новые методы управления работой генов. Простейший из них – генная терапия – использует различные химические вещества для активизации или подавления тех или иных генов. Однако доставка этих веществ в нужные клетки, а внутри клеток в нужные гены – далеко не простая задача.

Более эффективны в этом плане методы, использующие специфические белки или специальным образом синтезированные молекулы ДНК и сходные с ними РНК. Они открывают фантастические возможности не одной только активизации или подавления работы генов, но и для полного их изъятия в случае порчи из клеточной ДНК и даже замены другими такими же ге-нами, но здоровыми. Впрочем, в некоторых случаях и эти методы дают сбои, вызывая нежелательные побочные последствия. Недавно ученые из Медицинской школы университета Джонса Хопкинса (США) провели проверку применимости этих методов к стволовым клеткам человека. В распоряжении науки сегодня уже есть пути превращения клеток взрослого организма в полное подобие плюрипотентных (то есть способных по-разному специализироваться) эмбриональных клеток, и врачи возлагают на эти искусственные стволовые клетки большие надежды, рассчитывая выращивать из них нужные для пересадки органы и ткани. Тем более важно заранее выяснить, не будет ли сбоев в случае применения вышеупомянутых методов к таким клеткам.

В исследовании американских ученых два таких метода, известные в науке под названиями CRISPR и TALEN, сравнивались по способности вырезать нужные гены из ДНК искусственных стволовых клеток или заменять их другими генами. Для проверки были выбраны гены JAK2 и SERPINA1, мутации в которых вызывают определенные болезни, а также AAVS1, о котором не-давно стало известно, что в нем можно безопасно проводить эксперименты по внесению в ДНК чужеродных генов.

Но прежде чем рассказывать о результатах этой важной проверки, наверное, имеет смысл рассказать хотя бы вкратце, что такое эти TALEN и CRISPR и каким образом ученые ухитряются делать такие операции на генах - вырезать одни и вставлять вместо них другие. Ведь еще недавно сами эти слова показались бы чистой фантастикой. Все началось с бактерии ксантомонас. Эта бактерия имеет манеру заражать и портить многие полезные растения вроде перца, риса, лимона, хлопка, тома-тов и сои. Изучив механизм этой порчи, ученые обнаружили, что бактерия нарушает нормальный обмен веществ в растении путем воздействия на его ДНК неким своим белком. Белок этот особенный. Он содержит в своей цепи много повторяющихся групп химических звеньев, но 12-е и 13-е места в этой цепи могут занимать лишь несколько определенных звеньев, и в зависимости от конкретного вида этих двух звеньев белок получает способность узнавать тот или иной ген в ДНК растения-хозяина и присоединяться к нему, а присоединившись – активировать его работу (транскрипцию) в пользу бактерии. Соответственно, белок этот получил на-звание «транскрипционный активатороподобный эффектор», или, по-английски, TALE.

Ученые быстро поняли, что по образцу этого белка можно создавать в пробирках разные искусственные TALE, которые были бы способны распознавать нужные гены не только в ДНК растений, но и в ДНК животных или даже людей. А если еще соединить такой TALE с подходящими «ножницами», которые способны разрезать цепь ДНК там, куда их доставил TALE, то получится замечательное орудие для операций на генах. Такие «ножницы» уже были известны – это молекулы белков типа нуклеаз, и вот соединение TALE с N (от слова nuclease) как раз и привело к созданию вышеупомянутого TALENа. Практически эта техника выглядит так: зная, какой ген нужно разрезать, ученые находят, какой вид ДНК из ксантомас мог бы создать TALEN, способный этот ген рас-познать. Затем они искусственно синтезируют такой кусок ДНК в пробирке и внедряют его в клетку, которую собираются оперировать. Этот кусок ДНК внедряется в ДНК клетки и выдает программу на постройку TALENа, который затем начинает свою работу: он разрезает клеточную ДНК в нужном месте, и хотя клетки имеют способы сшивать такой разрез, но эти способы несовершенны и зачастую ген на месте сшивки вы-ходит из строя необратимо. Так достигается удаление гена. Если же нужно заменить его другим, то в клетки вместе с комплексом TALENа доставляется ослабленная до безопасности ДНК какого-нибудь вируса с прицепленным к ней нужным человеческим геном – и клетка при ремонте разрезанной ДНК, как правило, встраивает этот ген в месте сшивки.

TALEN – пример использования атакующего механизма бакте-рий, а вот CRISPR – это пример заимствования их защитного механизма. Уже в конце 1990-х годов выявилось, что бактерии имеют свою, хотя и примитивную, иммунную защиту. Устроена она очень интересно. В цепи ДНК бактерии есть большой участок, на котором регулярно повторяется одна и та же небольшая группа химических звеньев. Эти повторяющиеся группы разделены такими же небольшими участками ДНК, звенья в которых не принадле жат бактерии, а вырваны из ДНК различных бактериофагов. Бактериофаги – это злейшие враги бактерий, это вирусы, которые способны внедряться в бактерию и размножаться в ней. В ходе борьбы с такими вирусами бактерии обрели способность запоминать врага: они научились производить белки, с помощью которых можно вырезать кусочек вирусной ДНК размножающегося в них бактериофага и встроить в свою собственную ДНК. Если такой умной бактерии удавалось выжить после атаки одного вида вируса, она поступала так же при атаке другого, третьего и т. д., так что в ДНК доживших до нашего времени бактерий образовалась целая «библиотека» таких «опознавательных» кусков вирусных ДНК (разделенные повторами, они и образуют в бактериальной ДНК ее иммунный участок). Теперь при нападении на нее очередного вируса она строит копии всех хранящихся в этой библиотеке «опознавателей», прикрепляет к каждому из них особую молекулу-«крючок» и некий белок-«ножницы» (из породы уже знакомых нам нуклеаз) и посылает этот комплекс к ДНК врага. Если какой-то «опознаватель» из серии найдет в вирусной ДНК себе подобный кусок, молекула-«крючок» тут же прикрепляет весь комплекс к этому месту вирусной ДНК, и «ножницы» разрезают ее, кладя конец размножению вируса.

Недостаток такой иммунной за-щиты для самих бактерий со-стоит в том, что отведенное ей место в бактериальной ДНК невелико, хранится там лишь конечное число «опознавателей», и при появлении нового, ранее неизвестного вируса приходится удалять какой-то из старых, то есть терять иммунитет к нему. Но для науки куда важнее оказалось то, что эта примитивная иммунная система открывала возможность использовать готовый механизм распознавания и разрезания любых ДНК в любом нужном месте. По английскому названию этого механизма – clustered regularl interspaced short palindromic repeats (короткие, расположенные регулярными группами повторы-перевертыши) – этот новый метод «редактирования» генов получил сокращенное название CRISPR.

На практике эта техника, как и TALEN, намного сложнее, чем здесь рассказано, но сегодня ее практическое применение уже стало рутиной и позволило, например, китайским исследователям недавно создать обезьян с двумя измененными генами, а голландским ученым – исправить (пока в пробирке) мутировавший ген, который вызывает у людей наследственный кистозный фиброз. Но, разумеется, и этот замечательный метод имеет свои сбои, и потому, прежде чем внедрять его в медицину, его продолжают проверять в пробирке причем на всех видах человеческих клеток (включая раковые). А теперь, как уже говорилось в начале статьи, пришел черед человеческих стволовых клеток, и тут самое время вернуться к результатам той сравнительной проверки работы CRISPR и TALENа в искусственных стволовых клетках человека, которую проделали ученые из Сиэтла.

Результаты эти таковы. В вырезании генов CRISPR оказался почти в 100 раз эффективнее TALENа. Но в замене мутировавших частей генов они показали примерно одинаковую эффективность. При этом надежность их работы в стволовых клетках оказалась много больше, чем в клетках обычных. К тому же CRISPR обнаружил важную способность поражать только такие гены, где есть мутации, не затрагивая здоровые гены. Так что в целом оба метода проявили себя как высокоэффективные и вполне надежные генетические «редакторы», и это открывает дверь к их широкому использованию в исследованиях стволовых клеток с медицинской целью.

Рафаил Нудельман
"Окна", 2.04.2015