Храбрый Криспер и злобный Дракон

Иммунная система бактерий и архей, открытая в 1987 г., оказалась совершенно иной. Будучи одноклеточными, бактерии не могут выделять для своей защиты целую группу клеток, поэтому они выделяют для этих целей часть своей единственной ДНК. Ее появление можно представить себе так. В ходе эволюции мириады бактерий гибли ото вирусов, пока у какой-то из них появились белки-«ножницы», способные разрезать вирусную ДНК на куски. Один из таких кусков эта бактерия тут же встроила «на хранение» в свою ДНК. Теперь, когда в нее снова вторгался тот же вирус, она создавала (с помощью определенных белков) копию этой «памятки», присоединяла к ней «белки-ножницы» и отправляла получившийся комплекс против вирусной ДНК. Копия памятки играла роль молекулы-наводчицы: она распознавала себе подобное место в вирусной ДНК, соединялась с ним и подтягивала к нему белковые «ножницы», которые резали вирусную ДНК в этом месте и тем самым обезвреживали вирус. Такой процесс повторялся в ходе эволюции и с другим вирусами, и в результате у ныне живущих бактерий и архей есть целые библиотеки таких «опознавательных памяток» от ДНК разных вирусов, с которыми они встречались в прошлом. Это и есть их иммунная система, Криспер.

Недостаток такой «упрощенной» системы очевиден. Поскольку библиотека памяток находится прямо в ДНК бактерии, то размеры ее ограничены, ибо основная часть этой ДНК занята генами, необходимыми для жизнедеятельности бактерии. Поэтому, когда места для новой «памятки» уже не остается, бактерия удаляет из библиотеки самую старую из уже имеющихся и, соответственно, теряет «иммунитет» к ее вирусу. Но очевидны и достоинства этой иммунной системы: ее комплексы, подобно самонаводящимся ракетам, точно находят одно определенное место в ДНК вируса и режут ее именно в этом месте. И когда ученые в 2003-5 годах разобрались в устройстве и работе Криспера, они поняли, что это идеальное орудие для всевозможных генетических операций на ДНК – и не только на вирусных, потому что они быстро научились сами изготовлять «опознавательные памятки» (они же «молекулы-наводчики») для любых ДНК, операциями на которых хотели заниматься, и для любых нужных им мест на них. И понятно, что спектр таких искусственных «наводчиков» может быть как угодно широк – в лаборатории места достаточно. Ученые сумели превзойти природу также в изготовлении самых разных белковых «ножниц» (в науке они называются «Криспер-ассоциированными», или сокращенно КАС).

В то время, как естественные КАС (у бактерий и архей) имеют, как всякие ножницы, два «лезвия», т.е. способны разрезать обе длинные цепи, составляющие всякую ДНК, искусственные КАСы, созданные учеными, бывают и «с одним лезвием» т.е. способны перерезать только одну из двух цепей ДНК, причем выборочно, по заданию, ту или иную.

Все эти усовершенствования в конце концов привели к тому, что в руках у ученых оказался искусственный Криспер - замечательно гибкий и многогранный, как швейцарский нож, инструмент, с помощью которого можно производить генетические операции на любой ДНК – например, по желанию удалять, исправлять, подавлять и активировать любые гены или добавлять к ним некоторые молекулы, которые реагируют на свет или на какие-нибудь химические препараты, так что после этого можно управлять работой этих генов «дистанционно» - с помощью освещения (по микро-световоду) или введения этих препаратов.

Теперь, наконец, мы можем, вооружась полученными знаниями и томясь любопытством, двинуться вперед – а точнее, вернуться назад, - к рассказу о тех конкретных успехах, которые уже получены с помощью Криспера. Обо всех рассказать не позволит размер дозволенных Шехерезаде речей; скажу лишь, что на данный момент этим методом уже изучены – и изменены нужным для науки образом – ДНК всех т.н. модельных организмов, с которыми работают биологии: дрозофил, дрожжей, червей-нематод, мышей и т.д., - а также многих животных, от свиней до макак включительно.

Охватить все нельзя, поэтому расскажем лишь о достижениях, перечисленных в начале нашей заметки. Начнем с мышечной дистрофии Дюшена (МДД). Есть такая болезнь, которая сопровождается постепенным отмиранием мышечных волокон и приводит, в конце концов к параличу и ранней (порядка 25 лет) смерти. Болезнь эта обнаруживается уже в раннем возрасте, причем, в основном, у мальчиков (1 на 3600) и излечению не поддается, потому что вызвана врожденным повреждением генов, точнее – одного гена, расположенного на одной из ДНК, переданной от матери (на т.н. Х-хромосоме) и управляющего образованием белка дистрофин в мышечных клетках. В отсутствии дистрофина в клетку проникает слишком много кальция¸ это приводит к чрезмерному окислению, что, в свою очередь, вызывает некроз мышечного волокна.

Где тут место Крисперу? Ген дистрофина содержит около 80 функциональных отрезков (т.н. «эксонов»), разделенных пассивными «интронами». Уже известно, что тяжесть и скорость развития болезни зависят от числа пораженных мутацией эксонов; есть некое минимальное их число, при котором дистрофия Дюшена переходит в гораздо более легкую форму дистрофии Беккера (МДБ). Это навело профессора Герсбаха из университета Дьюка (США) на мысль использовать «ножницы» Криспера для удаления части пораженных эксонов. Пробы проводились, разумеется, на мышечных клетках, взятых у больного человека.

Оказалось, что перерезание ДНК больной клетки в одном только месте не дает результатов – клетка включает механизмы «ремонта» своей ДНК, и они «зашивают» разрез. То же произошло при перерезании ДНК в двух местах. Но по мере того, как исследователи наращивали длину вырезаемого участка (число удаленных из гена эксонов) «ремонт» происходил все медленнее и при длине в 10 эксонов (с 45-го по 55-й) прекратился совсем. «Прооперированные» клетки показали признаки перехода от МДД к МДБ. Более того, когда Герсбах ввел эти гены в организм мыши, они начали «работать», и в организме мыши появился здоровый человеческий дистрофин.

Еще более сложную задачу поставили перед собой биологи из группы профессора Андерсена из Бостона. На сей раз мишенью была печень. Среди заболеваний печени числится и т.н тирозинемия – неспособность печени расщеплять аминокислоту тирозин, поступающую с белковой пищей. Это тоже врожденная болезнь и тоже связанная с порчей определенного гена. Лечат таких больных с помощью строгой – и пожизненной - белковой диеты, потому что, если не лечить, накопление тирозина приводит к смерти. А лучшее лечение, как говорят врачи, это частичная или полная замена печени, но как редко это удается!

Андерсен пошел иным путем. Он решил использовать Криспер, и уже в 2014 году ему удалось вырезать испорченный ген. Однако клетки печени быстро восстанавливали его. И вот сейчас, в начале 2016 года с Андерсен сообщил о новой попытке – ему удалось не только вырезать испорченный ген, но и достаточно быстро вставить на его место здоровый, взятый из немутировавших клеток той же печени. Операция была тонкой. Молекула-наводчик и здоровый ген были введены в обезвреженную вирусную частицу, которая затем была введена в больные клетки печени. Через неделю эти клетки начали сами производить «наводчика» и здоровый ген. Тогда в клетки был введен (внутри специально изготовленной жировой наночастицы) ген для производства белков КАС, и клетки начали производить этот белок тоже. Через несколько дней производство КАСов прекращалось, и это было хорошо – им не хватало времени воздействовать на другие участки ДНК. Но нужные ее участки (т.н. испорченные гены) они успевали вырезать с помощью «наводчиков», и тогда к разрезу первыми присоединялись не «ремонтники» клетки, а уже готовые, блуждавшие в клетке здоровые гены, которые тут же встраивались в ДНК.

Об успехе попытки засвидетельствовал тот факт, что из каждых 16-ти больных клеток одна успевала стать здоровой. Это большой успех, потому что по данным врачей даже замена одной из 250-ти (!) больных клеток на здоровую делает тирозинемию относительно безопасной.

И под конец – о спиде (AIDS). Как известно, вирус этой болезни проникает в специфические иммунные клетки и встраивает свою ДНК в ДНК хозяина, после чего эта вирусная ДНК может годами «дремать» в хозяйской клетке, если инфицированный человек принимает соответствующие лекарства. Но стоит ему прекратить их прием, как вирус «оживает», что приводит к повторной и еще более опасной вспышке болезни. Группа доктора Калили из университета Темпл (США) и тут прибегла к введению молекул-«наводчиков» и КАС-«ножниц» в зараженные клетки.

Проверка метода производилась трижды. Сначала он был опробован на клетках в пробирке, и вторично - на живых клетках в питательной среде, причем каждый раз вырезался только какой-то кусок вирусной ДНК, встроившейся в иммунные клетки человека. Оба раза метод показал полную эффективность, и теперь. исследователи произвели третью и самую важную поверку: заразили человеческим вирусом AIDS мышей и крыс, генетически видоизмененных так, что вирус у них проникал во все важнейшие органы. Криспер и тут показал себя блестяще: он успешно удалил указанный кусок вирусной ДНК из всех зараженных органов. По мнению специалистов, это открывает принципиально новый и весьма перспективный путь к лечению AIDS у людей.

Как мы видели, Криспер открывает такой же многообещающий путь к лечению ряда других болезней. Что же стоит на этом пути? Понятно, что – переход к экспериментам на людях. Это само по себе - принципиальный «шаг в неведомое», но трудность еще в том, что во многих случаях «исправить» гены во всех клетках взрослого организма попросту невозможно и нужно делать это, когда клеток мало, т.е. на стадии эмбриона. И это, в принципе, возможно: в минувшем году две китайские группы уже произвели – и с успехом – «крисперные» изменения генов в человеческих эмбрионах (не имевших шанса на дальнейшее развитие). Но это вызвало естественный и понятный взрыв возражений со стороны специалистов по генетике и этике. И они правы: если вдуматься, Криспер открывает перед наукой не просто новые медицинские пути – он открывает также путь к любой желаемой (или насильственной) переделке человека. С появлением Криспера человечество неожиданно оказалось на пороге цивилизационной революции. Готово ли оно к этому? И как поставить барьер перед злоупотреблениями?

Рафаил Нудельман
"Окна", 9.6.2016